Molekylære kloningsprotokoller omfatte de prosedyrer som benyttes for å definere, isolering og replikerende DNA-sekvens. Tradisjonelle begrensning og ligation kloning protokoller initiere DNA fragmentering med begrensede endonucleases (enzymer som kutter DNA-trådene på restriksjonsseter), DNA fragment ligation (reparasjon av diskontinuiteter i DNA-molekyler), transfeksjon (innføring av nukleinsyre i en celle kroppen) og utvalg (utvelgelsen av enkelt genomer for replikering).

Isolation

Protokoller for isolering av et DNA-fragment, det første trinnet i molekylær kloning, benytter ofte en polymerase kjedereaksjon (PMR), som anvender sykluser av oppvarming og avkjøling for å forsterke biter av DNA. For å nå målet sekvens størrelsen andre protokoller inkluderer DNA sonikering, reaksjons enzym fordøyelse og bruk av kjemisk syntetiserte oligonukleotider. Disse protokoller variere avhengig av størrelsen og mengden av isolert DNA som trengs.

Ligation

Protokoller for ligering innebære å bruke et enzym, DNA-ligase, til å bli DNA-molekyler sammen med en kovalent binding. Protokoll tilsier å kombinere DNA-fragmenter, kloningsvektoren, en ligeringsbuffer, DNA ligase og sterilisert vann i et mikrosentrifugerør og inkubering over natten ved 4 grader Celsius.

Transfeksjon

Protokoller for transfeksjon eller infusjonen DNA inn i en celle ved å bruke en ikke-virale midler, ofte involverer injisering av DNA direkte inn i cellecytoplasmaet. Andre metoder inkluderer bruk av kjemiske reagenser, så som kalsiumfosfat, og lipider, for å levere transfeksjon kompleks gjennom cellemembranen. Denne metoden tester effekten av genmodifisering på funksjon av spesifikke gener.

Utvalg

Utvalg, eller screening, protokoller bestemme hvilke celler vellykket avholdt DNA innskuddet, og angi hvilke celler trenger isolasjon. En sentrifuge høster celler som inneholder transfektert DNA, som deretter blir inkubert i et lysozym (et naturlig forekommende enzym) buffer og behandlet med et alkalisk vaskemiddel, som gir proteiner og membraner oppløselighet. Ved hjelp av acetat for å utfelle proteinene, en sentrifuge og osteklede filter DNA-inneholdende supernatant (det oppløselige væskegjenværende fra en sentrifugert forbindelse). Supernatanten ble utfelt med polyetylenglykol, sentrifugeres og suspenderes i en cesium-klorid og etidiumbromid-buffer. Den etidiumbromid flekker DNA i henhold til tetthet, og ved hjelp av en langbølget UV-lys, blir det nedre bånd-DNA ekstrahert med fem cc sprøyte. En ionebytterkolonne ekvilibrert skiller DNA fra etidiumbromid og cesium-klorid, og den endelige DNA-pellet ble suspendert i en buffer løsning og detekteres på agarosegelelektroforese.