Digidexo.com

QuikChange Mutagenesis Protokoller

QuikChange mutagenese er merkenavnet på et kit som brukes i bioteknologisk forskning for å indusere genetisk mutasjon eller DNA endring. Agilent Technologies er selskapet bak produktet, som er tilgjengelig i to versjoner, QuikChange II og QuikChange Lightning. Begge settene inneholder en bufferløsning, enzymet DNA-polymerase, farge reagenser, DNA-sekvenser eller primere, og celleprøver.

Mutant Strand Synthesis Reaction Protocol

Teknikere syntetisere to oligonukleotider eller korte DNA-sekvenser inneholdende den ønskede mutasjon. Da de forbereder styre reaksjon med DNA-sekvenser, dNTP mix løsning og DNA-polymerase-enzym, tilsetning av destillert vann. Senere, de forbereder en serie av prøvereaksjoner ved hjelp av ulike konsentrasjoner av dobbelt-trådet DNA (dsDNA), samtidig som primer oligonukleotider eller konstant konsentrasjon, i henhold til produsentens instruksjoner. De holder prøvene ved 203 grader C i 30 sekunder. Den prøve som inneholdt DNA-segment nummer to blir også testet under temperatursvingninger, en teknikk hvor temperaturendringer i løpet av korte perioder av tid. Til slutt blir prøvene plassert på is i to minutter.

DPn-fordøyelse av amplifiseringsprodukter Protocol

DPN restriksjonsenzym kutter DNA på bestemte steder. En mikro-liter av dette enzymet blir tilsatt direkte til hver amplifikasjonsreaksjon under dens standard mineralolje legget ved hjelp av en mikro-pipette eller spesialisert aerosol-resistente pipettespissen. Imidlertid er en mineralolje overlegg bare nødvendig hvis den termosykler, en anordning anvendt for å amplifisere DNA-segmenter, ikke har en hot-top sammenstillingen. Reaksjonen er forsiktig blandet og senere satt i en mikrosentrifuge i ett minutt. Etter det, blir prøvene inkubert ved 98,6 ° C i én time.

Transformasjon av XL1-Blue Supercompetent Cells Protocol

XL1-Blue er et tetracyklin-resistente cellelinje som følger med QuikChange Mutagenesefremgangsmåter kits. I løpet av denne protokollen, teknikere tine cellene, som tidligere ble holdt på -112 grader C, på is. Så de legger en mikro-liter av DPN I-behandlet DNA, varme den til 107,6 grader C i 45 sekunder før du legger reaksjonen på is i to minutter. Etter denne fremgangsmåten, teknikere legge et preparat av NZY (kaseinhydrolysat og gjærekstrakt) forvarmet til 107,6 ° C og inkuberes i en time. Preparatet blir deretter lagt på agar-gel-plater og inkubert ved 98,6 ° C i 16 timer.