Kryopreservering prosedyrer er de som tillater cellene å bli lagret i det uendelige ved hjelp av ekstremt lave temperaturer for å suspendere metabolske aktiviteter. Det finnes to hovedtyper av nedfrysing prosedyrer: likevekt (vanlig treg frysing) og ikke-likevekt eller ultra-rask frysing (forglassing). Begrepet vitrification kommer fra det latinske "glasslegemet" eller glassaktig. Begge fremgangsmåter bruker cryoprotectants med frostvæske-type egenskaper for å forhindre cellulær skade under fryseprosessen. Når cellene er frosset eller forglasset, kan de lagres i det uendelige ved å dyppe dem i flytende nitrogen, et ekstremt kaldt fluid med en temperatur på -196 C (-321 C). For å gjenopprette metabolsk aktivitet i cellen etter tining må toksiske cryoprotectants bli fjernet fra cellen og den normale vannbalanse gjenopprettes etter hvert som cellen returneres til en normal funksjon temperatur.

Oversikt

Oversikt

Kryopreservering prosedyrer er de som tillater cellene å bli lagret i det uendelige ved hjelp av ekstremt lave temperaturer for å suspendere metabolske aktiviteter. Det finnes to hovedtyper av nedfrysing prosedyrer: likevekt (vanlig treg frysing) og ikke-likevekt eller ultra-rask frysing (forglassing). Begrepet vitrification kommer fra det latinske "glasslegemet" eller glassaktig. Begge fremgangsmåter bruker cryoprotectants med frostvæske-type egenskaper for å forhindre cellulær skade under fryseprosessen. Når cellene er frosset eller forglasset, kan de lagres i det uendelige ved å dyppe dem i flytende nitrogen, et ekstremt kaldt fluid med en temperatur på -196 C (-321 C). For å gjenopprette metabolsk aktivitet i cellen etter tining må toksiske cryoprotectants bli fjernet fra cellen og den normale vannbalanse gjenopprettes etter hvert som cellen returneres til en normal funksjon temperatur.

Cellespesifikke faktorer

Fremgangsmåten som brukes for å cryopreservere celler eller vev er avhengig av en rekke faktorer, inkludert størrelsen på cellen, mengde cellulære fluid (cytoplasma) og kompleksiteten av cellen (enkelt celle eller vev). Celler med en stor mengde av cytoplasma som egg er vanskeligere å cryopreservere enn celler med kun rest cytoplasma, som sædceller. Kryokonservering ovarial vev er mer utfordrende fordi minst tre forskjellige celletyper av varierende størrelser er til stede i eggstokk vev, hver med forskjellige optimale fryse behov. Langsom frysing-protokoller er blitt brukt med suksess med forskjellige typer av celler. Forglassing er for tiden mest effektive med encellede frysing og mindre effektivt med vev, men forskning pågår for å optimalisere vitrification av vev.

Rolle Cryobeskyttelsesmidler

Den cytoplasma til en celle inneholder vann, noe som viser seg å iskrystaller ved frysetemperatur. Når det dannes is inne i en celle, blir cellen strimlet og dør. Derfor må fluidet i cellen som skal fjernes før det når frysetemperaturer for å unngå celleskade. Forskjellige typer av frostvæske (kryobeskyttende) fluider kan brukes til å dehydratisere cellen før frysing, inkludert glycerol, propandiol, dimetyl sulfoxde (DMSO), etanol, og sukker slik som sukrose og trehalose. Den optimale hastighet på kjøle (og tining) avhenger av typen av kryobeskyttende brukt og på de karakteristiske for cellen eller vevet for å være (eller som var) frosset. Cryoprotectants er giftig for metabolizing cellene slik celle eksponeringer til cryoprotectants på varmere metabolske temperaturer må minimeres eller unngås. Ved tining eller oppvarming av cellene, må cryoprotectants fjernes helt fra cellen før metabolsk aktivitet blir gjenopprettet.

Equilibrium Versus Non-Equilibrium Kryopreservering Prosedyre

Frekvensen av frysing avhenger av om frysing protokollen er equilibrium- eller ikke-equilbrium basert. For likevekt typen prosedyrer, er den optimale frysehastighet oppnås når det er en balanse mellom den hastigheten som cellen blir dehydrert med vann og den hastigheten som vannet utenfor cellen blir transformert til is-stadiet. Disse likevekts eller slow-fryse protokoller vanligvis ta flere timer å fullføre, og en datamaskin blir brukt til å kjøre en programmerbar sats fryser for å sikre at frysing priser er nøyaktig slik de skal. Det er vanligvis en "hold" trinn i protokollen nær begynnelsen til å tillate manuell opprettelse av start iskrystaller eller "seeding" i fluidet utenfor cellene.

I vitrification, er en helt annen tilnærming til frysing som ikke er avhengig av ramper og oppnå en likevekt mellom dehydrering og iskrystalldannelse brukt. Forglassing er så ultra-hurtig at det ikke er tilstrekkelig tid for dannelse av is og cellevæsken blir omdannet direkte inn i en glasslegemet eller glassfasen, uten skade på cellen. Programmerbare rente frysere er ikke nødvendig fordi cellen er direkte kastet ut i ekstremt kaldt flytende nitrogen, oppnå en øyeblikkelig glassaktig tilstand.

Slow-Freeze Prosedyre

Det første trinn i den langsomme fryseprosedyre er å eksponere cellen for å kryobeskyttende i en gradvis trinnvis måte for å tillate langsomt ekvilibrering av cellen med det kryobeskyttende mens slippe vann. Når cellene er blitt fjernet av de fleste celle vann, blir cellene i det kryobeskyttende fluid plassert i en beholder av en eller annen form, slik som et plastrør, en glassampulle eller en plast vial.The væskevolum som omgir cellene for langsom frysing er vanligvis mindre enn en teskje, og kan bare være noen få dråper. Den pre-merket beholder er fylt, forseglet og satt i en programmerbar fryser, som langsomt senker temperaturen i beholderen over en periode på minutter eller timer til meget lave temperaturer. Etter noen minutter med kjøling, må start iskrystaller dannes i beholderen ved å "seede" beholderen. Såing utføres ved hjelp av et verktøy (for eksempel tang) som er blitt pre-kjølt i flytende nitrogen for å berøre beholderen og føre iskrystalldannelse. Dette starter krystall vil initiere kontrollert iskrystalldannelse på ett sted, trygt borte fra cellene. Etter såing er fullført, kan resten av kjøle ramper fortsette. Når beholderen har nådd en temperatur på mellom -30 og -85 C, kan den beholder som inneholder cellene bli kastet direkte inn i flytende nitrogen for å fullføre avkjøling til -196 C.

Forglassing

Ultra-rapid ikke-likevekt kjøling prosedyrer som forglassing bruke høyere konsentrasjoner av kryobeskyttende midler kombinert med en nesten øyeblikkelig frysing som oppnås ved å dyppe celler direkte inn i flytende nitrogen. Forglassing omgår is-krystalldannelse fase og beveger vannet direkte inn i en glass-aktig fase. Forglassing oppnår det samme endepunkt som langsom frysing, men med en hastighet på -3000C / min, sammenlignet med 10C / min eller mer. For forglassing, blir cellene vanligvis plassert på tuppen av en halm og overskudd av kryobeskyttende middel er fjernet, slik at bare nok til at cellen klynger seg til beholderen ved overflatespenning, før stuper i flytende nitrogen. Fordi frysing er så hurtig, er varigheten av eksponering for cryoprotectants mye mindre og mye høyere konsentrasjoner av kryobeskyttende midler kan bli tolerert av cellen. Oppvarming av cellen for å returnere den til normal metabolsk funksjon må også være utrolig rask. Håndtering av glassert prøvene er mye mer krevende enn treg-frosne prøvene fordi selv en kort eksponering til en temperatur over den for flytende nitrogen kan starte en uønsket oppvarming prosessen og gjenfrysing, noe som er skadelig for cellen.