Digidexo.com

Slik feilsøker en Tre Fragment Ligation

Slik feilsøker en Tre Fragment Ligation


Ligering er en metode som brukes i biologisk forskning for å bli med separate tråder av DNA. Prosessen er blitt forenklet ved bruk av kommersielt tilgjengelige ligeringssett. En ligeringsprosedyren blir vanligvis etterfulgt av transformasjon, en prosess som setter den sammenføyde DNA inn i en bakteriell vektor mottaker, å klone og forsterke DNA. På grunn av kompleksiteten av fremgangsmåten, resultatene ofte ikke stemmer overens med det ønskede produkt og krever feilsøking. Dette er mer dominerende i et forsøk på å bli flere fragmenter, for eksempel i trippel ligering.

Bruksanvisning

Feilsøke Transformation

•  Formulere en liste over tiltak som er involvert i ligering og transformasjon. Feilsøking noen vitenskapelig protokoll begynner vanligvis med det siste trinnet, ved å gå baklengs.

Sammenlign rensede DNA-produkt fra prøven til kontroll-DNA, levert med kittet. Når DNA har blitt transformert og klonet inn i bakterier, kan det bli isolert, renset og kontrolleres ved hjelp av agarose-gelelektroforese. Resultatene for elektroforese ville indikere om transformasjon var vellykket.

Bestem bakterievekst i løpet av kloning. De fleste bakterielle vektorer er konstruert slik at bare de som har en DNA-innskuddet - vil vokse i et medium inneholdende ampicillin, eller andre antibiotika. Dårlig vekst kunne fastslå at DNA-prøven ikke ble satt inn i vektoren.

Bekreft at ligerte DNA-prøve ble renset, før transformasjon. Buffersalter og ligering enzymer kunne hemme transformasjon av det innsatte DNA. Det er også viktig å forsikre seg om at ligerings enzymet ble inaktivert ved hjelp av varme, etter gjennomføring av ligeringsprosedyren. Aktiv ligase kan potensielt forstyrre transformasjon.

Sjekk datoen på bakteriell lager brukes for transformasjon. Gamle bakterieceller løs effektivitet over tid. Til slutt ble bakteriecellene er i stand til transformering og kvalitet kloning. Når prosessen med transformasjon har blitt diagnostisert, kan du begynne å analysere ligation prosedyre.

Feilsøking Ligation

Bekreft renheten av DNA-prøve, før ligering. Salt forurensninger i DNA-prøven kan resultere i dårlig ligering. DNA-prøven bør være renset og fri for salter og enzymer, før den brukes i ligering.

Bekreft om endene av DNA-trådene som skal ligerte er sløv eller klissete. Ligering brukes til å koble egne tråder med butte ender eller klebrige ender, etter fordøyelse med utpekte restriksjonsenzymer. T4 DNA ligase er enzymet av valget for butte enden DNA - men det vil også arbeide for DNA med klebrige ender. Andre DNA ligaser kan bare fungere for DNA, etter en begrensning digest å skape klebrige ender. Det er viktig å bruke riktig ligase for DNA testet.

Kontroller konsentrasjonen av DNA-prøver før ligering. Ved hjelp av DNA med høy konsentrasjon fører ofte DNA til å bli lineær. Instruksjonene i settet vil gi informasjon om den riktige mengden av DNA som skal brukes i en ligation reaksjon.

Sett ligase enzym med et nytt parti. Enzymer er spesielt følsomme ved romtemperatur og fortsatt fryse-tine-sykluser. Ligasen kan skades etter en rekke anvendelser, bare ved frysing og tining for mange ganger. Noen kits anbefaler at ligase alikvoteres i mindre porsjoner i løpet av første gangs bruk, for å redusere antall ganger det er re-frosset.

Kontroller ligation kit. Ofte problemet med ligation bruker et kit som er utløpt eller blitt forurenset med annet DNA og salter.

Tips og advarsler

  • Du kan finne nyttig informasjon fra produsenten av ligeringssett. Årsaken til ligation ineffektivitet ble trolig observert før og rapportert til produsenten. Utviklerne av kommersielle ligation kits kan gi deg verdifull informasjon og bistå i feilsøkingsarbeidet.
  • Ligering og transformasjon er prosedyrer som fungerer sammen. Det er vanlig for komplikasjoner å oppstå under transformasjonen etter en vellykket ligeringsprosess. Derfor er det viktig å diagnostisere transformasjon, samt ligering.