Digidexo.com

Slik utfører en ELISA-analysen

Slik utfører en ELISA-analysen


En ELISA, eller enzymbundet immunoabsorbans måling, er en biokjemisk laboratorieteknikk utført for å påvise et antigen (slik som et protein) eller antistoff i en forsøksprøve. Analysen tar fordel av antistoff-antigen-binding, og kan brukes for å bestemme andre celle og molekylære bindingsmekanismer i tillegg.

I et proteinbasert ELISA-analysen, er en "fange" antistoff eller protein fastsatt i en analyse skål og fikk følge fatet, hvoretter "probe" middel (for eksempel ens protein av interesse) er lagt ned og inkuberes med fangst agent. Etter flere vaskinger, er en "deteksjon" antistoff tilsettes for å visualisere nærværet eller fravær av antistoff-antigen eller protein-proteinbinding.

Bruksanvisning

Fortynn en fangst-antistoff til 5 ug / ml i 50 mM NaHCO2 (pH 9,6). Tilsett 50 ul til hver brønn av prøven fatet brukt for testing. Dekk med plast eller aluminium og inkuberes over natten ved 4 grader C på en shaker.

Dump ut fangst antistoff og vask to ganger med 200 ul PT buffer. Tilsett 200 ul med blokkeringsbuffer per brønn (PB eller 5 prosent skummet melk). Ruge alt fra to timer til over natten mens risting ved 4 grader C.

Dump ut blokkeringsbuffer og vask fire ganger med 200 ul PT buffer. Legg "probe" proteinprøver på ulike konsentrasjoner i PB eller 5 prosent skummet melk, og legger 100 uL per brønn. Inkuber en time risting ved 4 ° C dumpe ut probe løsninger og vaske seks ganger med 200 pl buffer PT.

til påvisningsantistoff (HRP-konjugert antistoff) fortynnet 1: 4000 i PB-buffer eller 5 prosent skummet melk (enten en inneholdende 0,05 prosent Tween-20), tilsetning av 50 uL per prøve godt. Inkuber i 30 minutter til en times rysting ved 4 grader C.

dumpe ut deteksjon-antistoff-oppløsning og vaske seks ganger med 200 pl PT buffer per brønn, etterfulgt av vasking to ganger med 200 ul av 1 x PBS (fosfat-bufret saltløsning). Dumpe ut PBS og tilsett 100 il deteksjonsreagens per brønn (for HRP, bruker ferske blandet TMB reagens ved å blande TMB-substrat og peroxide på 1: 1).

Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur, risting og til.

Ved bruk av TMB og HRP: Endelig tilsettes 100 pl 1 M H3PO4 (fosforsyre) per brønn for å stanse reaksjonen TBM.

Les plate ved hjelp av prøveanalysen leser, for eksempel en 96-brønners plateleser. (For HRP og TMB, bruk "ELISA End-Point-analyse" mal tilgjengelig på de fleste lesere.)

Tips og advarsler

  • Ferskt blande TBM substratet og peroksyd, og holde bestanddelene adskilt og ved 4 ° C før blanding og bruk.
  • Mens enten PB buffer eller 5 prosent skummet melk kan anvendes som en blokkerende buffer, være konsistent i å bruke den ene eller den andre gjennom hele analysen.
  • Fosforsyre (H3PO4) er etsende og farlig; bruke hansker og ekstra forsiktighet ved håndtering av dette.