Western blot-analyse er en velkjent teknikk for identifisering av spesifikke proteiner isolert fra vev. De forskjellige proteiner blir først separert ved omkostninger og vekt på SDS-polyakrylamid-gel og overført til en nitrocellulosemembran. Etter overføring, merkede antistoffer bindes spesifikt med det ønskede protein, og er fotografert ved hjelp av røntgenfilm eller visualisert ved protein-spesifikk flekk. Det endelige resultatet viser mørke bånd som indikerer tilstedeværelsen av den identifiserte protein. Denne artikkelen fokuserer på de grunnleggende metodikk for å utføre Western blot analyse i et laboratorium kvalifisert for komplekse protein forskning.

Bruksanvisning

Overføre Proteiner til Nitrocellulose Membran

Klargjør nitrocellulose membran. Membranen bør være dyppet i destillert vann i to minutter, deretter plassert i overføringsbuffer og tillates å virke i fem minutter.

Monter en overføring smørbrød bestående av svamp / filter papir / SDS PAGE / nitrocellulosemembran / filter papir / svamp. Sandwich er innrettet slik at membranen ligger nærmere anoden og gelen nærmere katoden inne i overføringskammeret.

til overføringsbuffer i kammeret slik sandwich er neddykket. Plasser kammer inne i laboratoriet kjøleskap. Overføring av proteinet fra gelen til membranen bør utføres ved 4 grader Celsius.

Sett opp strømforsyningen til å overføre proteinene fra gelen på membranen. Retning av overføringen er mot anoden indikeres av den røde kabelen. Større proteiner beveger seg hurtigere som reaksjon på en elektrisk strøm, og vil bevege seg først. Strømforsyningen styrer hastigheten av overføringen. Sette kraft til 30 V og 40 mA for en overnatting overføring.

demontere strømforsyningen etter overføringen er fullført. Ikke ta kontakt med overføring buffer eller fjerne sandwich mens strømforsyningen er koblet til.

6. Fjern membranen fra sandwich og inkuberes i to timer i blokkeringsløsning. Proteiner i den blokkerende løsning vil absorbere inn i membranen hvor ingen proteiner er til stede. Det vil forhindre ethvert antistoff å binde seg til membranen hvor det ønskede protein ikke er tilstede.

Binde Antistoff

•  Inkuber nitrocellulosemembranen med primært antistoff-løsning ved hjelp av et røreverk. Membranen må være fullstendig neddykket i oppløsningen i minst en time. Det er akseptabelt å inkubere over natten.

8. Vask membranen grundig for å fjerne ubundet antistoff. Fire separate ti-minutters vaskinger med TBS er vanligvis tilstrekkelig for å fjerne overskudd av antistoff.

9. Inkuber membranen i merket antistoffkonjugat løsning ved hjelp av røreverk. Membranen må inkuberes i minst en time. Det merkede antistoff-konjugat er bundet til alkalisk fosfatase. Det er den enzym-antistoff-blanding som vil gjenkjenne og binde seg til det første antistoff.

Påvisning av Protein

Skyll membranen i 10 minutter i PBS fire ganger. Dette vil fjerne resten av den merkede antistoff-konjugat.

Inkuber membranen i alkalisk fosfatase substratoppløsning inntil bandet mønstre vises. Fargestoffet i substratet løsningen vil bindes til antistoff-antigen-protein i membranen og danner en mørk-farget bånd. Prosessen kan være umiddelbar eller kreve opptil 30 minutter før båndene er observert.

Pakk membranen helt i cellofan og plassere den direkte på gel-imager for å visualisere resultatene. Gel-imager er i stand til å fotografere resultatene som vises på Western blot membran.