Digidexo.com

Hvordan gjennomføre en FRET analyse

Hvordan gjennomføre en FRET analyse


Fluorescens resonans energioverføring (FRET) er en analyseteknikk som brukes til å måle tilstedeværelsen og mengden av binding mellom to rapportørbundne proteiner. Denne analysen er vanligvis brukes til å analysere potensielt bindende proteiner i forskjellige celletyper, og for å måle effektiviteten av konjugering-type enzymer. Påvisnings utstyr som er nødvendig, avhenger i stor grad av den type rapportørmolekyler som blir brukt, selv om mange ganger en enkelt 96-brønners plateleser kan brukes.

Bruksanvisning

Oppsett og Reading

Generer eller forberede fusjonskonstruksjoner i hver protein av interesse, med hvert å være knyttet til en fluorescens-overføring molekyl som grønn fluorescerende protein (GFP), rhodamin eller boron-dipyrromethene (BODIPY).

•  Bestem absorbans og emisjonsbølgelengder på hver fluorescerende komponent og av den totale analyse. (For eksempel, hvis analysen måler GFP -> Rhodamine fluorescens-energioverføring, er inngangsbølgelengden som absorbans av GFP absorbans (488 nm), og utslipp deteksjonsbølgelengde er at for rhodamin (595 nm)).

Lag passende reaksjonsbuffer for forsøket, avhengig av proteiner av interesse biokjemiske egenskaper. En TRIS-basert buffer er ofte brukt, blant kalsiumklorid og 0,05 prosent Tween-20. Spesifikke konsentrasjoner og komponenter kan bestemmes ved å søke etter posteringer detaljering lignende reaksjoner og betingelser.

Bland de to rapportør-konjugerte proteiner av interesse i forskjellige konsentrasjoner i reaksjonsbuffer, og alikvoter 50-200 ul per brønn. Legg til en konjugering enzym (for eksempel sortase) til hver prøve godt dersom det er hensiktsmessig. Ved å utføre en slutt-punkt-analyse, tillater inkubering ved romtemperatur (eller i enzymenes optimale temperatur) i en bestemt tidsperiode, og deretter lese på 96-brønners plateleser. Hvis du utfører en kinetikk analysen, går du direkte til lesing (se nedenfor).

Sett prøven plate i 96-brønners plateleser. Lag et nytt eksperiment siden og få tilgang til innstillingsmenyen. Input riktig absorbans (eksitasjon) og utslippsbølgelengder, må du velge riktige brønnene som skal leses.

Hvis du utfører en kinetikk eksperiment, satt tids løpet av eksperimentet og opplesninger intervall (for eksempel en gang hvert 10 minutt).

Begynne å lese prøven.

Analysere data ved hjelp av Microsoft Excel graffunksjon (eller en annen grafisk program som GraphPad).

Tips og advarsler

  • Prøven plate kan ferdigblandet i 5 til 10 sekunder før du leser ved hjelp av en 96-brønns plate leserens manuell "Mix" funksjon.
  • Utføre serielle fortynninger av proteinene av interesse, og av enzymet for å oppnå optimale resultater.
  • Ikke la prøvene som skal utsettes for lys i lengre perioder, siden dette kan redusere aktiviteten til de fluorescerende reportermolekyler.