Digidexo.com

Hvordan lage en restriksjonskartet

Hvordan lage en restriksjonskartet


I de tidlige dagene av molekylærbiologi, forskere brukte begrensning kartlegging for å forstå de genene de studerte. I moderne forskningslaboratorier, er begrensning kartlegging i stor grad foreldet fordi sekvensering har blitt mer allment tilgjengelig og mer økonomisk enn tidligere. Det finnes imidlertid tilfeller hvor et restriksjonskart kan være tilstrekkelig for en forsker for å utføre sine undersøkelser. Den generelle metode til restriksjonskartlegging innebærer bruk av fordøyelsesenzymer for å bryte ned en fysisk prøve av DNA. Når du måle produkter av denne fordøyelsen, kan du "montere" bitene og utlede den opprinnelige sekvensen av DNA.

Hvordan lage en restriksjonskartet

DNA Fordøyelse

•  Legg en begrensning enzym til DNA-prøve. Bruk EcoR1, et enzym som vanligvis anvendes, f.eks.

til denne blanding til en bufferløsning, som i hovedsak er et sted for at reaksjonen skal opptre.

•  Hev temperaturen av reaksjonen som indikert i New England Biolabs manual. Hvert restriksjonsenzym har en spesifikk reaksjonstemperatur ved hvilken fungerer den beste. I tillegg har hvert enzym en spesifikk nukleotidsekvens som den er utformet for å målrette. EcoRI vil skanne og kutte DNA ved nucleotidsekvensen CAATTC. Denne nøyaktige rekkefølgen av nukleotider må finnes for enzymet til å binde og kutte DNA. Inntil dette punktet, bør alle materialer holdes på is for å hindre uønsket aktivitet.

Etter at reaksjonen skal opptre som angitt i bruksanvisningen, kjøres blandingen i en gelelektroforese maskin for å skille DNA-fragmenter basert på størrelse. De minste fragmenter vil bevege seg lengst over gel.

Mål avstanden reist med hver DNA-fragment. Bør gjentas Disse fem trinn med flere forskjellige enzymer hver for seg.

Konstruere restriksjonskartet

Bruke data innhentet fra gelen, samle all informasjon du har funnet ved hjelp av de ulike restriksjonsenzymer.

Utlede rekkefølgen på restriksjonsseter ved å sammenligne de ulike fragmentlengder produsert av hvert enzym. Hvis for eksempel enzymet 1 ga to fragmenter av lik lengde og enzym # 2 fremstilt tre fragmenter av samme lengde, kan konkludere med at enzymet # 1 kutt halvveis i DNA og enzym # 2 kutter av DNA inn i tredeler.

Bruk av konklusjonene i trinn 2, montere rekkefølgen av restriksjonsseter for DNA.

Hint

  • Se i New England BioLabs lab manual for en mer detaljert beskrivelse på restriksjonskartlegging protokollen.