I de fleste biologiske eksperimenter på cellekultur, et avgjørende skritt inkluderer å vite hvilke celler er i live og som er døde i prøven. Dye eksklusjon er den mest populære metoden for å måle celle levedyktighet. Fargestoffeksklusjon er basert på teorien om at levende celler inneholder intakte membraner og døde celler ikke, og dermed døde celler absorbere fargestoffet inn i cytoplasma. Det finnes ulike fargestoffer og protokoller og metodene du velger bør være basert på kostnader, følsomhet, enkel og lengde av prosedyren. Trypanblått er et vanlig fargestoff som brukes til å måle cellenes levedyktighet, fordi fremgangsmåten kan utføres i fem til ti minutter og koster bare mengden av fargestoffet reagens.

Bruksanvisning

Få en pellet av cellene du måler.

•  Resuspender cellepelleten i PBS for å få omtrent 5 x 105 celler / ml. PBS blir brukt fordi levedyktighet målinger er mer nøyaktige når cellene er i et serumfritt miljø; serumproteiner kan også flekker og gi deg misvisende resultater.

til like deler av cellesuspensjonen i PBS til like deler av 0,4% trypanblått-farvestoff for å oppnå en 1 til 2 fortynning (eksempel: 100 ul av celler til 100 ul av trypanblått) og bland ved å pipettere opp og ned.

Inkuber blandingen til mindre enn tre minutter ved romtemperatur. Dersom cellene blir tellet etter omtrent fem minutter, vil levedyktighet være unøyaktig på grunn av celledød.

Med dekkglass som allerede er på plass, fylles på hver side av et hemacytometer teller med cellesuspensjonen. Vanligvis vil hver side ta 10 til 20 ul.

Plasser hemacytometer på scenen av et lysmikroskop og fokus på cellene.

Hver side av hemacytometer inneholder flere firkanter. Telle det totale antall celler i en firkant av hemacytometer. Deretter telle antall ikke-levedyktig (blå) og levedyktige (klar) celler separat, på samme plassen.

8. Beregn prosentandel av levedyktige celler i kvadrat ved å dividere antallet levedyktige celler ved det totale antallet celler og multiplisere med 100. gjøre dette for flere kvadrater på hemacytometer for å oppnå en gjennomsnittlig levedyktighet måling.

Tips og advarsler

• Telle døde celler kan være subjektiv, avhengig av hva teknikeren anser en blå celle (intensiteten av den blå farge kan variere avhengig av hvor mye som ble absorbert inn i cytoplasma). Derfor er det lurt å gjøre en levedyktighet måling med minst to separate prøver og få et gjennomsnitt. Alternativt kan teknikeren få en annen person til å også utføre tellingen og sammenligne resultatene.
• Bruke personlig verneutstyr når du utfører denne analysen, som hansker og en frakk. Ifølge sikkerhetsdatablad (HMS), kan trypanblått forårsake kreft, så øve egnede laboratorium sikkerhetsmetoder.